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LAMP相關產品

環介導等溫擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一種新型的核酸擴增技術,基本原理是采用4/6條特異引物和具有鏈置換功能的DNA聚合酶(如Bst DNA聚合酶),在65℃恒溫擴增核酸,使鏈置換DNA 的合成不停地自我循環;反應的過程主要分為循環擴增反應起始物的形成和循環擴增反應。LAMP 檢測體系中基因的擴增效率極高,可在 30~60min 擴增 109~1010 倍,同時反應過程中,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的 Mg2+結合,產生副產物焦磷酸鎂--乳白色沉淀,便于對反應結果的觀測,使擴增和檢測一步就可以完成,大大提高檢測效率。目前,該技術已經應用于人類和動物病原體的快速檢測和疫病診斷,基于此技術的廣泛應用和助力LAMP技術更好的應用于實踐的宗旨,我公司提供多種恒溫擴增DN A聚合酶和LAMP引物設計服務,主要產品如下:
貨號 名稱 用途
A3801 Bst 2.0 DNA 聚合酶 DNA LAMP
A3901 Bst 3.0 RNA/DNA聚合酶 RNA/DNA LAMP
A3805 Bst 4.0 RNA/DNA聚合酶 RNA/DNA LAMP
A3808 LAMP TaqMan擴增試劑盒 LAMP TaqMan探針法擴增反應
A3802 LAMP-HNB變色擴增試劑盒 LAMP羥基萘酚藍變色反應
A3803 LAMP濁度擴增試劑盒 LAMP擴增通過濁度觀察
A4401 LAMP引物 LAMP擴增
A3806 熱蠟凍干DNA/RNA LAMP HNB 試劑 LAMP擴增

主要特征

  • 實現核酸的恒溫擴增,無需核酸擴增儀,一臺水浴鍋即可;
  • 高特異性,采用4/6條特異引物識別目的基因上的6/8個區域;
  • 擴增速度快,效率高,可在30-60min內獲得結果;
  • 結果判定簡單,肉眼即可判斷擴增效果。
  • LAMP引物設計

    LAMP引物的設計主要是針對靶基因的六個不同的區域,基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc區以及5' 端的Bl、B2和B3區等6個不同的位點設計4種或6種引物。
    FIP:上游內部引物,由F2區和F1C區域組成,F2區與靶基因3’端的F2c區域互補,F1C區與靶基因5' 端的Flc區域序列相同。
    F3引物:上游外部引物,由F3區組成,并與靶基因的F3c區域互補。
    BIP引物:下游內部引物,由B1C和B2區域組成,B2區與靶基因3' 端的B2c區域互補,B1C域與靶基因5' 端的Blc區域序列相同.
    B3引物:下游外部引物,由B3區域組成,和靶基因的B3c區域互補。
    1.被擴增的靶序列長度最好不要超過200bp。
    2.內引物的末端最好不要富含AT堿基對,其末端穩定性自由能(△G)值小于-4kcal/mol。
    3.TM 值要求 F1c/B1c=64~65℃; F2/B2=59~61℃;F3/B3=59~61℃;LoopF/LoopB=64~65℃。
    4.GC 含量 盡可能保證引物的 GC 含量在 40~65%。
    5.引物間距F2的5’末端到B2的5’末端約為120~160bp;F2的5’末端到F1c的5’末端約為40~60bp;F3的3’末端到F2的5’末端約為0~60bp;LoopF 位于 F2c的3’末端和 F1c的5’末端之間; LoopB 位于B1的3’末端和B2的5’末端之間;
    6. 引物設計軟件:
    在線設計:PrimerExplorer V5:http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html
    本地設計:LAMP Designer 如需設計,可發送email至[email protected],我們提供免費設計服務。

    LAMP結果判定

    1. 羥基萘酚藍(HNB)法:
    羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑,當溶液中存在Mg2+時,顏色為紫色,而隨著反應的進行,由于大量焦磷酸根離子的生成與Mg2+相結合,消耗了溶液中的Mg2+,顏色會由紫色變為天藍色。

    2. TaqMan探針法:
    應用六條特異性引物和一條TaqMan探針,在具有強鏈置換能力、高效DNA合成能力、具有外切酶活性的Bst DNA聚合酶的作用下,切割探針后產生熒光信號。

    3. 肉眼觀察焦磷酸鎂白色沉淀法
    LAMP在反應過程中,由于其反應效率高,速度快等特點,在反應中dNTP會解離出大量的焦磷酸根離子,與溶液中的鎂離子相結合生成焦磷酸鎂白色沉淀,而焦磷酸鎂的生成量和DNA的擴增量呈正比。

    4. 鈣黃綠素法
    鈣黃素(Calcein)就是一中金屬離子絡合劑,它需要和熒光淬滅劑Mn2+一起使用,當反應體系中存在這兩種物質時,隨著陽性反應的進行生成大量的焦磷酸根離子,與鈣黃綠素競爭結合Mn2+,從而使Calcein缺少了Mn2+而開始出現熒光,當反應結束后,陽性結果為淺綠色

    5. 瓊脂糖電泳法
    LAMP擴增的產物是不同大小的DNA片段,瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外燈照射下能夠觀察到大小不等的梯度條帶。

    6. 濁度監控法
    LAMP擴增反應, 產生大量的焦磷酸鎂白色沉淀,反應液的濁度上升,用濁度儀監測其濁度可反映出LAMP擴增產物的情況,可設陰性對照檢測引物的特異性。

    使用方法

    1.典型的DNA LAMP擴增反應,以Bst2.0 DNA聚合酶為例2.典型的RNA LAMP擴增反應,以Bst3.0 DNA聚合酶為例
    反應體系配制
    Bst2.0 DNA Polymerase (8 U/μl)                     0.25~1 μl
    10×Bst Buffer                                                     2.5 μl
    dNTP Mixture (10 mM each)                                3.5 μl
    100 mM MgSO4                                                 1.5 μl
    模板DNA                                                    10 ng~1 μg
    *10xPrimers                                                        2.5 μl
    ddH2O                                                      Up to 25 μl
    *10X Primers:16 μM FIP/BIP, 2 μM F3/B3, 4 μM LoopF/B each。
    反應條件: 65°C 30~60min; 85°C 5min 失活。
    反應體系配制
    Bst3.0 DNA Polymerase (8 U/μl)                     0.25~1 μl
    10×Bst Buffer                                                     2.5 μl
    dNTP Mixture (10 mM each)                                3.5 μl
    100 mM MgSO4                                                 1.5 μl
    模板DNA                                                     1 ng~1 μg
    *10xPrimers                                                        2.5 μl
    ddH2O                                                      Up to 25 μl
    **10X Primers:16 μM FIP/BIP, 2 μM F3/B3, 4 μM LoopF/B each。
    反應條件: 70°C 30~60min; 98°C 15min 失活。
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